Спектральный проточный цитометр EasyFLO

Спектральный проточный цитометр EasyFLO (Hangzhou EXPEC Technology Co.,Ltd, Китай).

· Бюджетная модель EasyFLO – 1 или 2 лазера (488 нм и 488 / 635 нм)

· Спектральная детекция 500 - 835 нм

· Максимальная свобода в выборе флуорохромов и составлении панелей, не нужна компенсация

Классическая (conventional) проточная цитометрия – доступный и устоявшийся метод, подкрепленный огромным корпусом и данных, и стандартизированных протоколов, хорошо подходит для простых панелей. Спектральная (spectral) проточная цитометрия обеспечивает более высокий уровень сложности, позволяя работать с многоцветными панелями, разделяя близкородственные флуорохромы и упрощая работу с автофлуоресценцией, что делает этот подход исключительно эффективным для многопараметрического анализа.

Технология спектральной проточной цитометрии основана на регистрации полного спектра эмиссии флуорохромов и позволяет различать метки с перекрывающимися спектрами (за счет различий в непиковых областях спектра). В классической проточной цитометрии в оптической схеме используются дихроичные зеркала и дискретные полосовые фильтры эмиссии, выделяющие определенные длины волн, в то время как спектральная проточная цитометрия при помощи «спектрального» блока детекторов захватывает множество точек по всему спектру испускания каждого флуорохрома (рисунок 1).

Каждый флуорохром показывает уникальное распределение испускаемого света (эмиссии флуоресценции) по спектру (спектральная сигнатура, spectral signature). Это распределение удобно представить путем построения графика интенсивности сигнала по оси Y и распределения плотности событий, происходящих на каждом детекторе, по оси X (рисунок 2). Цветовой градиент - от красного (указывающего на высокую интенсивность) до синего (указывающего на низкую интенсивность) - отображает распределение флуоресценции. Это позволяет различать флуорохромы, даже те, у которых перекрываются спектры испускания, путем выделения конкретных областей длин волн, на которых каждый флуорохром испускает наиболее сильно. Чтобы сравнить спектральные сигнатуры между двумя или более флуорохромами, сигнатуры необходимо нормализовать и сравнить их общие формы.

Рисунок 2. Схематическое представление распределения эмиссии флуорохрома по зонам (каналам) детекции в спектральной цитометрии

Одной из проблем в классической проточной цитометрии является собственная флуоресценция клеток (аутофлуоресценция). Спектральная проточная цитометрия может обрабатывать автофлуоресценцию как отдельный сигнал, который необходимо или вычесть, усиливая целевые флуоресцентные сигналы, или рассматривать как отдельный характеризующий систему параметр.

Таким образом, спектральная проточная цитометрия заметно увеличивает возможности мультиплексирования и позволяет глубже детализировать субпопуляционный анализ, расширяя наше понимание сложных биологических систем и процессов.

Принципиальное различие между классической и спектральной проточной цитометрией - способ отделения вклада каждого флуорохрома от остальных, используемых в эксперименте (рисунок 3). Классическая цитометрия для коррекции перекрывающихся спектров от соседних флуорохромов и изоляции индивидуального вклада использует процесс компенсации (создание матрицы компенсации), а спектральная цитометрия - для разделения собранного сигнала на спектральный вклад каждого флуорохрома применяет т.н. спектральное разделение (spectral unmixing).

Рисунок 3. Схематическое представление процессов компенсации и спектрального разделения

И компенсация, и спектральное разделение (оба процесса выполняется автоматически специализированным программным обеспечением) корректируют спектральное перекрытие и разделяют различные флуоресцентные сигналы. Компенсация использует матрицу (spillover matrix), в то время как спектральное разделение для расчетов задействует референтные спектры флуорохромов (готовая библиотека референтных спектров наиболее распространенных меток является частью управляющего спектральным цитометром ПО и может дополняться по мере необходимости). При измерении полностью окрашенного образца общая флуоресценция представляет собой наложение спектров всех используемых флуорохромов, из которого при помощи математических алгоритмов спектрального разделения вычленяется точный вклад каждого флуорохрома.

В процессе работы и анализа на спектральном цитометре и графическое представление данных (помимо спектральной сигнатуры), и выгрузка результатов осуществляются в точно таких же видах и форматах, как и для классической проточной цитометрии.